当需要以纳米级分辨率观察样品超微结构时，科学家通常借助电子显微镜（观察表面结构的扫描电镜 sem 和观察内部结构的透射电镜 tem）——它们是当前科研界可使用的最大显微成像工具。
电镜成像要求对样品进行通常 20-150 nm的超薄切片，使用超薄切片机切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且无人为干扰因素，因此可以满足电镜成像对制备样品的严苛要求。如果大量超薄切片具有样品结构的前后连续性，sem 成像采集的图像就可以进行样品内部结构的 3d 重建，形成可用于分析的完整超微、精细立体图像，即连续断层成像技术（array tomography, at）。
今天，小编简要介绍一下 at 成功的关键环节：连续超薄切片样品制备。
111超薄切片之重要性111
at 常用于细胞、蛋白质等生物 / 生物大分子结构的纳米分辨率、3d 结构观察和分析，主要步骤为包埋样品连续（超薄）切片、tem / sem 或光学显微镜对其进行成像、对获得的一系列图像进行重建分析。at 可以获得的有效信息包括超微结构的定量、体积分析和细胞 / 蛋白的形态学数据等，相较于共聚焦显微镜获得的图像，具有更高的水平和空间分辨率（可达 0.2 nm）。
超薄切片主要用于 tem 成像前的样品制备，以纳米分辨率观察样品内部结构信息。无污染且获取快速的超薄切片的主要优势在于：
整个切片均可用于电镜成像，适合大尺寸样品分析；
单张切片电子透射均一性好，保证结果可靠性；
制备速度快，短时间即可获得大量切片；
适用样品范围广，生物样本和工业材料均适用。
11超薄切片的基本原理11
对于 tem 或者 3d 结构重建，样品高质量连续切片是前提。因此，一台如 leica em uc7 或者 em artos 3d（20-50 nm）（见图 1）一样稳定可靠的超薄切片机是开展实验的必备工具。
▲图 1. leica 连续超薄切片机新品 —— em artos 3d
样品被安装在可上下前后精准移动的电动机械臂上，机械臂垂直上下移动、遇到固定的玻璃刀或钻石刀时，这条样品带被切下（图 2），然后刀台自动向左移动，按照设定的切片厚度完成第二条切割。同理，随后刀台再向左移动，完成第三条切割（图 3）。从刀片上直接取下切片是十分困难的，因为它非常薄且脆弱，徕卡超薄切片机采用温和水流托举的方式使条带不断分离，能够保证条带质量不被破坏同时操作极其简单（冷冻切片情况可借助显微操作），然后进行上电镜前的其它必要处理。
▲ 图 2. em artos 3d 超薄切片机样品切割位置基本结构
▲ 图 3. em artos 3d 制备的连续超薄切片条带
连续断层成像的样品制备
多数未处理的生物样品比较柔软，at 成像前的样品制备主要包括下面几个步骤：
组织固定
样品水分抽提和包埋
连续切片和切片条带收集
切片染色以用于成像（如果需要）
最后使用 sem 或光学显微镜（通常荧光成像情况）对结构上具有连续性的切片进行成像，合成图像以进行 3d 重建和分析。
对于市面上多数超薄切片机，使用者在 at 成像的样品制备时，通常会发现这是一项耗时耗力、中间一些操作必须手工完成的工作。em artos 3d 是 leica 2019 年新推出的高端 3d 连续超薄切片机，能够自动化连续切片、显著缩短样品制备时间、减少人工操作、切片无褶皱、厚度均一、温和水流取条带、提高样品制备成功率等众多优点，在向下兼容普通超薄切片需要的同时，特别合适高通量切片和 at 等前沿研究对样品制备的严苛要求 
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▲ 图 4. at 技术获得的鼠淋巴结 3d 结构重建
（来源：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司）

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